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生化培養箱在多管發(fā)酵法的應用分析

更新更新時(shí)間:2013-06-19 點(diǎn)擊次數:2179
 1.多管發(fā)酵法
初發(fā)酵實(shí)驗 發(fā)酵管內裝有單倍或三倍乳糖蛋白胨培養液,并在內倒置有小玻璃管。每個(gè)樣品用三個(gè)不同的水樣量接種,同一接種水樣量要有五管,將水樣分別接種到裝有乳糖蛋白胨培養液的發(fā)酵管中,在37℃±0.5℃下培養24h±2h。乳糖能起選擇作用,因為很多細菌不能發(fā)酵乳糖,而大腸菌群能發(fā)酵乳糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣。培養液中加入溴甲酚紫作為酸度指示劑,細菌產(chǎn)酸后,培養液即由原來(lái)的紫色變成黃色。產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管表明試驗陽(yáng)性,如在倒管內產(chǎn)氣不明顯,可輕拍發(fā)酵管,有小氣泡升起為陽(yáng)性。
復發(fā)酵實(shí)驗 輕微振蕩初發(fā)酵試驗陽(yáng)性結果的發(fā)酵管,用3mm接種環(huán)將培養物(2-3環(huán))轉接到EC培養液中,在44.5℃±0.5℃下培養24h±2h(提高培養溫度可造成不利于來(lái)自自然環(huán)境的大腸菌群的生長(cháng))。培養后立即觀(guān)察,發(fā)酵管產(chǎn)氣則證實(shí)為糞大腸菌群陽(yáng)性。
2.濾膜法
濾膜是一種微孔性濾膜,孔徑0.45μm。將水樣注入已滅菌的放有濾膜的過(guò)濾器中,經(jīng)過(guò)抽濾,細菌即被截留在膜上,然后將濾膜貼于M-FC培養基上,在44.5℃±0.5℃下培養24 h±2h。糞大腸菌群菌落在M-FC培養基上呈藍色或藍綠色,其他非糞大腸菌群菌落成灰色、淡黃色或無(wú)色。正常情況下,由于溫度和玫瑰酸鹽試劑的選擇性作用,在M-FC培養基上很少見(jiàn)到非糞大腸菌菌落。
二.兩種方法的注意事項
1.培養溫度的要求 總大腸菌群中的細菌除生活在腸道中外,在自然環(huán)境中的水與土壤中也經(jīng)常存在,但此等在自然環(huán)境中生活的大腸菌群培養的zui合適溫度為25℃左右,如在37℃培養則仍可生長(cháng),但如將培養溫度再升高至44.5℃,則不再生長(cháng),而直接來(lái)自糞便的大腸菌群細菌,習慣于37℃左右生長(cháng),如將培養溫度升高至44.5℃仍可繼續生長(cháng)。因此,可用提高培養溫度的方法將自然環(huán)境中的大腸菌群與糞便中的大腸菌群區分,兩種方法也都基于此理。將接種好的樣品或裝有濾膜的培養基放入 生化培養箱 時(shí),箱內溫度一定要達到所要求的溫度(44.5±0.5℃)時(shí),方可放入。如用恒溫水浴箱時(shí),其水面要高于接種物面,放濾膜的培養皿要沉到水浴箱底部。
2.加氯水樣的處理 經(jīng)氯處理消毒過(guò)的水樣,水中含有一定量的余氯,使大腸菌群處于受損或受抑制狀態(tài),在采集水樣時(shí)應提前在采樣瓶中加硫代硫酸鈉,硫代硫酸鈉可以脫氯,使受損的細菌得以復蘇與修復,從而避免出現計數結果偏低甚至假陰性的現象。此外余氯對濾膜法培養的細菌其抑制作用尤為明顯,所以抽濾時(shí)應對水樣進(jìn)行大量無(wú)菌水稀釋?zhuān)詼p少余氯的殘留。
3.樣品的保存 采樣用的容器使用前應蓋好瓶蓋,用牛皮紙將瓶蓋和瓶頸處包裹好,置干燥箱160℃-170℃干熱滅菌2h,或用高壓蒸汽滅菌器121℃滅菌15min。采樣后水樣的正確保存也很重要,如保存不當可使樣品中的大腸菌群細菌死亡或在一定條件下再生長(cháng),這些都將影響檢測結果的準確性。檢測室接到水樣后,應立即檢測,如因故不能檢測時(shí),應立即將樣品置于冰箱內(2℃-10℃)并于2小時(shí)內檢測。
4.培養物質(zhì)的制備與保存
⑴.多管發(fā)酵法所使用的培養液在分裝于各發(fā)酵管中后,應將發(fā)酵管盡快放于高壓蒸汽滅菌器中,在115℃滅菌20min(注意:這個(gè)溫度也應控制好,既達到滅菌的作用,還要防止培養物質(zhì)分解流失),然后貯存于冰箱或暗處備用。
⑵.濾膜法所采用的M-FC培養基多使用外購的成品,培養基中苯胺藍的純度和質(zhì)量往往影響菌落的顏色,因此,無(wú)菌包裝的成套培養基在使用前,先接種典型糞大腸菌,以觀(guān)察對比菌落的顏色,來(lái)鑒定其穩定性。
5.結果統計
⑴.多管發(fā)酵法的結果是根據不同接種量的發(fā)酵管所出現陽(yáng)性結果的數目,從MPN表中查得相應的MPN指數,來(lái)計算每升水中糞大腸菌群細菌的MPN值。MPN是“Most Probable Number”的縮寫(xiě),指zui大可能數,它是根據統計學(xué)理論,估計水體中的菌群密度和衛生質(zhì)量的一種方法,所以準確判斷不同接種量發(fā)酵管的陽(yáng)性數是非常重要的,否則將導致較大偏差。
⑵.濾膜法的結果是計數濾膜上呈藍或藍綠色的菌落,來(lái)計算出每升水樣中的糞大腸菌群數。所以為便于計數,減少誤差,理想的水樣體積是一片濾膜上生長(cháng)20-60個(gè)糞大腸菌群菌落。
三.在實(shí)際中的應用探討
1.檢測方法對樣品的適用性
⑴.多管發(fā)酵法由于只需要根據水樣的取樣量來(lái)決定將樣品培養于何種培養液中(單倍或是三倍乳糖)進(jìn)行培養,因此理論上可適用于各種水樣,但由于受發(fā)酵管容積的限制,其更適合檢測水源水、地表水和污染源廢水(取樣量不大),而且如果接種的水樣量不是MPN表中的三種接種量時(shí),還需用公式進(jìn)行換算。
⑵.濾膜法主要是采用抽濾裝置將細菌截留在濾膜上,然后將濾膜貼附在固體培養基上培養,因此可用于檢測體積較大的水樣,但受濾膜孔徑的限制,在檢測混濁度高(污染源廢水)、非大腸桿菌類(lèi)細菌密度大(河湖水)的水樣時(shí),對菌落計數統計有一定影響,此外,如水樣中有毒性物質(zhì)較高,也會(huì )在濾膜上形成累積,抑制細菌培養。
2.檢測時(shí)間及操作過(guò)程的繁瑣度
⑴.多管發(fā)酵法需要經(jīng)過(guò)初發(fā)酵試驗和復發(fā)酵試驗兩個(gè)過(guò)程后才能根據不同接種量的發(fā)酵管所出現陽(yáng)性結果的數目,從MPN表中查得相應的MPN指數,從而zui后得出每升水中糞大腸菌群細菌的MPN值??梢钥闯?,多管發(fā)酵法的培養時(shí)間至少需要2天以上,且對接種量、每一接種量的發(fā)酵管數都有嚴格要求(MPN表多采用9管、15管發(fā)酵管,接種量為10ml、1ml、0.1ml3種體積查詢(xún)),否則結果難以統計。
⑵.濾膜法目前主要采用成套NPS(濾膜+培養基+培養皿)進(jìn)行細菌截留和培養,操作簡(jiǎn)單,使用時(shí)只需用少量無(wú)菌水潤濕培養基墊即可使用,培養時(shí)間1天左右,能比多管發(fā)酵法更快地獲得結果,還具有高度的再現性和精密性。此外由于采用單片無(wú)菌包裝,節省了滅菌時(shí)間,還避免操作過(guò)程中的二次污染,并且長(cháng)有菌落的濾膜片可在紫外線(xiàn)滅菌、干燥后作為檢測記錄*保存,更符合計量認證規范。
3.檢測成本的考慮
⑴.多管發(fā)酵法所用的發(fā)酵管、小玻璃倒管和塑料蓋可在清洗、高壓滅菌和紫外線(xiàn)消毒后重復使用,液態(tài)培養基可自行配制或采用市售已配好的綜合培養基,檢測的成本不高。由于其方法較繁瑣,目前正有一種經(jīng)過(guò)US EPA認證的水和廢水中糞大腸菌群檢測的標準方法逐步取代它,這種在美國、日本和加拿大等國家廣泛使用的檢測技術(shù)在國內也有一定使用(北京市環(huán)境檢測中心、北京市排水集團檢測中心等),這種方法就是使用IDEXX colilert試劑來(lái)檢測水中糞大腸菌,雖然它是基于多管發(fā)酵法原理,不過(guò)卻將其操作大大簡(jiǎn)化了。當然,伴隨著(zhù)操作的簡(jiǎn)化,檢測成本也大幅提高,設備基本上全是進(jìn)口的,前期投入大概在8萬(wàn)元至10萬(wàn)元人民幣之間,且由于采樣瓶、試劑和密封計數盤(pán)都是一次性使用,單個(gè)樣品的檢測成本也將達到200元人民幣左右。
⑵.濾膜法主要采用的抽濾裝置(拋光不銹鋼3歧管過(guò)濾器、500ml漏斗、無(wú)油隔膜真空正壓兩用泵和手動(dòng)無(wú)菌水加液器)也基本上來(lái)自于進(jìn)口,目前很多單位使用的都是德國賽多利斯公司生產(chǎn)的產(chǎn)品,其前期投入大概在2萬(wàn)元至3萬(wàn)元人民幣左右(包括100套無(wú)菌包裝的NPS,12元/每套)。由于每個(gè)樣品需采用3種不同的稀釋比進(jìn)行過(guò)濾培養,要使用3套NPS,所以單個(gè)樣品的檢測成本在50元人民幣左右。
四.建議
從兩者在幾個(gè)方面的比較可以看出,濾膜法具有省時(shí)、省料、設備要求低以及可以采集較多的檢測水樣等優(yōu)點(diǎn),而且隨著(zhù)應急檢測機制的建立,當需要我們對各種突發(fā)環(huán)境污染事件(醫院廢水是否加氯處理、河湖是否受生活廢水污染)迅速做出反應,更快地獲得肯定結果的時(shí)候,其優(yōu)點(diǎn)越發(fā)突出。
因此在實(shí)際檢測工作中,我們可以將濾膜法作為主要檢測方法,并采取措施克服其易受水樣混濁度、其它菌種和有毒物質(zhì)干擾的局限性,快速反映水質(zhì)情況,為監督管理部門(mén)提供科學(xué)數據;將多管發(fā)酵法作為輔助方法,通過(guò)其來(lái)對濾膜法培養的可疑菌種進(jìn)行鑒定,從而使檢測結果更加準確,只有這樣,水中的細菌學(xué)檢測才能順利、的開(kāi)展。

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